三代测序技术：让你“看清”微生物基因“骨架”(2)

对此，王军表示，二代测序技术是目前的主流测序方式，已广泛应用于疾病和癌症的研究，具有高通量的特点，但不足之处在于测出来的基因片段较短，对于复杂的基因组区域以及较大的结构变异的检测有一定的局限性。而三代测序技术则能够帮助研究者针对感兴趣的基因或区域进行高深度测序研究。目前，三代测序技术已被应用于疾病或癌症领域人类基因遗传标志物、融合基因、甲基化检测等研究中，方法主要有长片段PCR扩增、CRISPR/Cas9靶向捕获和液相探针捕获三类。

在研究中，王军课题组使用了二代测序与三代测序数据组装拼接的办法。“引入三代测序能够弥补二代测序‘序列短’这一不足。三代测序读出的长序列就像一个‘骨架’，能够让研究者知道二代测序读出来的短片段之间有什么对应关系，该怎样拼接，从而提高整体基因拼接序列的质量，提高对某个生物染色体的全面认识。”王军说。

在三代测序方法出现之前，研究者利用二代测序技术拼出大大小小的不同基因片段，但常常无法知道某些片段属于哪个菌种。王军表示，虽然存在一些计算方法使研究者可以依据峰段、频率去推断基因片段之间的关系，但由于缺乏直接证据，这一研究难题仍无法得到根本解决。

“三代测序技术改变了这一情况。将三代测序技术得出的数据与二代的进行混合拼接，就能够在很复杂的环境中几乎接近拼出一个细菌的单个基因组。”王军说。

三代测序技术未来还有更大发展空间

近年来，全球实验室都开始大规模应用三代测序技术。

“每一个新测序技术刚出来的时候一般都很贵，大家都觉得是在‘烧钱’做研究。”王军向记者介绍，尽管三代测序技术为精细探索基因功能提供了新的路径，但其经济性仍不高，“三代测序技术的单位测序数据成本比二代要高很多。每次测序非常贵，一次出来的数据量约为二代的1/10，有时甚至还不到二代的3%。数据量少的特性是由三代测序技术的原理决定的。”

在充斥着电解液的容器中，放置镶嵌有纳米孔蛋白的分子膜。在相关蛋白质和酶的辅助下，DNA分子以较为稳定的速度通过纳米孔，当纳米孔内被特定的核苷酸占据时，会对孔周围的电流产生扰动。通过记录DNA分子通过纳米孔过程中产生的电流信号情况，再将这一特异性的电信号序列利用算法软件翻译为核苷酸序列，这就是三代测序技术的基本操作原理。

“目前的工艺决定了三代测序技术测出的数据量偏少。”王军说，但其与二代测序技术相结合，能为建立更高质量的基因图谱作出贡献。

下一步，三代测序技术还有哪些发展空间？

在王军看来，开发序列信息解读算法是一个发展方向。如何精确地将新一代基于纳米孔的单分子实时电信号测序技术生成的原始电信号翻译为序列信息，是科学家们关注的重点，近年来也诞生了多种用于精确翻译电信号的相关工具。

同时，三代测序技术还能在甲基化检测等特殊领域发挥重要作用。三代测序技术能够检测DNA分子自身的物理化学特性，因此生物基因组上的修饰信息也可以在电信号中得到反应。DNA分子上的甲基化修饰具有非常强的细胞特异性和细胞周期特异性，对表观遗传学研究有着重要的意义。