中国团队设计新冠疫苗新平台 发布mRNA动物实验数据(2)

　　由于糖基化影响疫苗的免疫原性和免疫优势，实验检查了病毒模拟颗粒表面刺突的糖基化状态。值得注意的是，PNGase F处理后，S2带向下移动，表明病毒模拟颗粒上的刺突蛋白被N-连接的糖基化修饰，这与质谱法揭示的SARS-CoV-2的近期发现一致。

　　接下来，研究者将病毒模拟颗粒转导至293T细胞并评估了刺突蛋白的表达。在感染后36小时收获了细胞，进行Western印迹分析。在这里，研究者仍然观察到病毒模拟颗粒在293T细胞中的刺突蛋白表达，表明VSV-G被共组装成病毒模拟颗粒，从而扩大了它们的向性。研究者发现了两个主要的刺突带，可能是糖基化的全长单刺突及其二聚体/三聚体形式。

　　此外，研究者使用共聚焦分析法对转染或转导的293T细胞进行了确认，其表达了刺突。为了检查病毒模拟颗粒的先天免疫特性，使用THP-1衍生的巨噬细胞作为核酸传感模型，发现I型干扰素(IFN)和IFN刺激的基因ISG-15和视黄酸诱导的基因没有明显增加I(RIG-I)。由于带刺突的病毒模拟颗粒比野生型对应物更有效地掺入了刺突的mRNA和蛋白，因此研究者选择它作为体内评估的候选疫苗(指定为ShaCoVacc)。

　　为了获得ShaCoVacc的免疫原性，研究者将候选疫苗注射到C57BL / 6J小鼠中。在接种疫苗后两周后，对小鼠血清进行了酶联免疫吸附测定(ELISA)，以获取刺突特异性IgG。研究者观察到了刺突特异性IgG的显著诱导。

　　为了评估中和抗体的产生，还使用了编码萤火虫荧光素酶的刺突假型HIV进行了中和测定——一种成熟的伪病毒中和测定。有趣的是，在研究中，单次注射ShaCoVacc可以诱导针对SARS-CoV-2的即刻有效免疫反应，而灭活疫苗则需要至少两次或三剂注射。

　　研究者还采用了刺突假型慢病毒，该慢病毒编码GFP来转导Huh-7细胞。实验发现，用来自疫苗接种小鼠的1:40稀释血清进行的预培养几乎完全消除了荧光，这对于安慰剂组和阳性对照很明显。有趣的是，来自接种小鼠的血清在Huh-7细胞中没有抑制VSV-G假型慢病毒的转导，这表明中和抗体具有刺突特异性。

　　T细胞免疫应答通常对于疫苗控制病毒感染的功能很重要。但是，在COVID-19中，细胞因子的过度产生与症状严重程度相关。因此，研究团队认为，对于任何SARS5 CoV-2疫苗，细胞免疫都必须谨慎。

　　在这项研究中，通过模拟带有刺突衍生肽池的脾细胞来评估T细胞免疫反应。研究者没有发现IFN-γ和IL-2的表达增加，这表明对于ShaCoVacc而言，刺突特异性细胞免疫反应并不显著。这与最近的灭活SARS-CoV-2疫苗研究相一致，该疫苗具有保护作用，但未发现接种猕猴的淋巴细胞和关键细胞因子的百分比有显著变化。此外，在疫苗接种过程中未发现ShaCoVacc引起的体重减轻，表明无明显毒性。

　　通过解剖接种疫苗的小鼠，可进一步了解刺突特异性抗体的线性表位特征，研究者使用了一种新开发的肽微阵列，其中包含覆盖刺突整个长度的短肽。研究者发现，与疫苗接种组的某些刺突肽相对应的信号强度各不相同，安慰剂治疗的小鼠则未观察到信号。

　　研究团队还量化了分别针对S1域和受体结合域(RBD)的抗体的信号强度。接种小鼠的血清在两个结构域均引发了明显较高的信号，这与此前刺突特异性抗体的ELISA分析和中和测定相吻合。