施一公团队发文报道最高分辨率剪接体结构(2)

尽管之前积累了大量剪接体结构研究的经验，施一公研究组在针对如何捕获稳定的B* complex时，却是举步维艰，困难重重。由于B* complex和C complex是第一步剪接反应发生时一前一后的两个状态，领域内对其鉴定的核心区别在于5’剪接位点与分支点之间的磷酸二脂键是否形成。因此，在不影响剪接体正常组装和激活的前提下，如何阻止第一步反应发生，并且保持5’剪接位点与分支点已经进入RNA剪接的活性反应中心，并形成反应前的活性位点，成为本文研究的最大难点。施一公研究组分别进行了体内内源直接阻断和体外建立剪接反应阻断等方法的尝试，最终都无法获得稳定的B* complex样品。在最新发表的这篇《细胞》文章中，施一公研究组将体内阻断与体外建立剪接反应相结合，对提纯方案多次探索，最终优化出一套可以获得稳定的、性质良好的B* complex样品。为了探索剪接体对不同pre-mRNA底物的识别特异性，施一公研究组选取了领域内常用的两种pre-mRNA作为剪接体结合的底物，随后利用单颗粒冷冻电镜技术重构出了4个不同构象B* complex整体分辨率为2.9埃-3.8埃的冷冻电镜结构，并搭建了原子模型，其中包含了4条RNA和35个蛋白（图2）。

图2 酿酒酵母催化激活剪接体4个构象的三维结构

该文解析的4个不同构象的B* complex结构，首次展示了RNA剪接第一步反应发生过程中分支点如何被剪接体逐步“推入”活性反应中心的动态变化，其中第一步剪接因子Yju2在稳定分支点中发挥了举足轻重的作用，尽管此时5’剪接位点与分支点的距离十分接近（4.3埃），却不足以形成磷酸二脂键。从而，该结构也清晰地揭示了关键蛋白因子Cwc25在激发第一步剪接反应中的重要作用（图3）。值得一提的是，在这个结构中，第一次观察到了pre-mRNA中分支点A被5’剪接位点GU通过经典的碱基互补配对以及碱基堆积力共同识别的机制，这个结构信息进一步证明了该位点在真核生物中高度保守的重要性。本文另一大亮点是首次揭示了剪接体对不同pre-mRNA底物识别的特异性，为体内不同pre-mRNA的剪接效率存在差异提供了最直接的结构信息。

图3 酿酒酵母剪接体介导分支反应的模型

截至目前为止，施一公研究组在酵母中一共解析了10个不同状态的剪接体高分辨的三维结构（如图4），成果全部发表于国际顶级期刊《科学》和《细胞》（Science 7篇，Cell 3篇），从组装到被激活，从发生两步转酯反应发生到剪接体的解聚，这10个状态的剪接体完整覆盖了剪接通路，首次将剪接体介导的RNA剪接过程完整的串联起来，为理解RNA剪接的分子机理提供了最清晰、最全面的结构信息。（观看完整视频请点文末链接）

图4 施一公研究组解析的酵母剪接体结构汇总

（图片来源: https://ygshi.org/research）