基因重组节制技能获打破

 
 
基因重组节制技能获打破  
 

Cre-loxP重组酶系统是一种位点特异的基因重组技能，可以迅速而有效地实现各类生理情况下的基因定点插入、删除、替换和倒位等操纵，具有高效性、特异性强、应用范畴广等特点。连年来，科学家将合成生物学理念融入Cre-loxP重组酶系统中，开拓出了一系列调控式的Cre-loxP重组酶系统，如化学要领诱导的Cre-loxP重组酶系统和紫光/蓝光诱导的Cre-loxP重组酶系统。但这些诱导系统仍然具有必然水平的毒性，且紫蓝光的组织穿透性差，极大地限制了Cre-loxP重组酶系统在动物体内的应用。

 

7月24日，华东师范大学生命科学学院、医学合成生物学研究中心研究员叶海峰课题组在《自然—通讯》上颁发最新研究成就，他们将合成生物学要领和光遗传学技能相团结，设计开拓了一套远红光调控的支解型Cre-loxP重组酶系统(简称FISC系统)，具有低毒、高度时空特异和强组织穿透性，乐成实此刻小鼠体内对靶基因的高效准确改革。

 

叶海峰向《中国科学报》先容，他们操作课题组前期开拓的远红光调控的哺乳动物细胞转基因表达节制系统，将能响应远红光和合成c-di-GMP的光敏卵白BphS，响应c-di-GMP的BldD卵白以及Cre重组酶举办公道拼接组装。研究人员将Cre重组酶分成CreN59（第1–59个氨基酸）和CreC60（第60–343个氨基酸）两部门，个中CreN59与Coh2卵白融合被构成型启动子表达，CreC60与DocS卵白融合被远红光诱导表达（图1）。

 

图1 FISC事情道理

 

首先，研究人员通过优化差异启动子、差异质粒量、卵白间毗连肽以及差异Cre重组酶浸染序列，获得了最优版本的FISC系统，最佳诱导基因表达倍数高达约120倍。别的，在哺乳细胞中测试了FISC系统动力学表征，功效显示在差异的陈诉卵白和差异的细胞系中，FISC系统都揭示出精采的调控结果。在HEK-293细胞中，FISC系统具有光照强度和时间依赖性以及高度的时空特异性（图2）。

 

图2 FISC的动力学表征

 

随后，研究人员通过流体动力学打针法将FISC系统递送到BALB/c小鼠体内，探究FISC系统在体内的事情环境，并与今朝已颁发的两套蓝光调控Cre-loxP系统举办较量。功效，显示FISC系统在体内揭示出更高效的基因重组效率（54.4倍），这也充实浮现了远红光的组织穿透性优势，进一步证明白FISC系统在动物体内极具应用优势（图3）。

 

图3 FISC系统在体内重组的事情环境

 

进一步地，研究人员回收电转的要领，将FISC系统递送到tdTomato转基因陈诉小鼠肌肉中，小鼠经远红光照射后，在体内诱导合成的Cre重组酶会切割基因组上的loxP序列，切除STOP序列，表达tdTomato赤色荧光卵白。功效发明，在mRNA和卵白程度上FISC系统均揭示出比蓝光调控的Cre-loxP系统更高的DNA重组效率。

 

叶海峰先容，腺相关病毒AAV因为其具有免疫原性低和非整合性等优势，今朝是临床治疗上应用较为遍及的基因载体。为了实现体内高效递送，研究人员将FISC系统构建在AAV载体上，操作AAV病毒将FISC系统递送到tdTomato转基因陈诉小鼠中。通过调查小鼠活体成像和肝脏成像，与暗中组小鼠对比，光照组小鼠赤色荧光卵白表达量显著升高（图4），说明操作AAV载体乐成实现了FISC系统在小鼠体内介导的DNA重组。

 

图4  AAV病毒将FISC系统递送到tdTomato转基因陈诉小鼠