相邻胞嘧啶，不再傻傻分不清

 
 
相邻胞嘧啶，不再傻傻分不清  
 

  7月15日，《科学—希望》在线颁发了美国莱斯大学高雪研究组与中国农业科学院深圳农业基因所左二伟研究组相助开拓的新型精准单碱基编辑东西，将使持续胞嘧啶（C）区域的精准碱基编辑成为大概。

胞嘧啶碱基编辑器（CBE）由胞嘧啶脱氨酶和nCas9卵白融合构成。个中，经典的胞嘧啶碱基编辑器BE4max CBE是由鼠源脱氨酶APOBEC1、nCas9卵白和两个尿嘧啶糖基化酶抑制剂组成。该项研究基于布局生物学改革了一类人源脱氨酶A3G, 并用其替代BE4max CBE中的鼠源脱氨酶，使A3G-CBE可以或许最洪流平地只编辑靶向碱基C而不影响与其紧邻无关的C。

单碱基编辑面对精度挑战

左二伟汇报《中国科学报》，与传统基因编辑计策对比，基于CRISPR/Cas9系统的DNA单碱基编辑技能不会发生DNA双链断裂, 因此制止了由易错DNA修复通路所引入的随机序列插入和删除（Indels），从而极大地提高了编辑效率和产品纯度，为基因编辑应用在遗传疾病的基本研究和治疗带来了曙光。

胞嘧啶碱基编辑器可以或许在靶基因座上高效地举办胞嘧啶到胸腺嘧啶（C-to-T）的转换，并已经被用于相关疾病动物模子治疗研究，譬喻更正由地中海贫血症。

“可是，单碱基编辑仍然面对精度挑战。”左二伟举例说，当靶向碱基C紧邻的碱基也是C时, 今朝的CBE碱基编辑器很难区分它们。因为两个相邻的碱基C往往城市被编辑，从而无法到达精准更正相关疾病的目标。这为利用CBE编辑器研究和治疗此类遗传疾病带来了很大坚苦。

改革脱氨酶

高雪先容，之前研究表白，野生型的人源脱氨酶A3G主要对DNA单链5′-CCC-3′基因组序列中的第三个C发生脱氨基浸染，即由C编辑为T。因此，这种选择性有很大潜力被用于持续C区域的准确碱基编辑。

他们首先通过暗码子优化，将野生型的A3G用于替换BE4 max中的鼠源脱氨酶rAPOBEC1，构建出A3G-BE 2.1。

因为A3G 的N-端布局域会导致A3G单体的聚积，并阻止A3G的脱氨活性；而A3G的C端布局域自己足以脱氨。为了提高编辑效率，他们进一步构建了只保存C端布局域的A3G-BE 4.4。

高雪先容，在细胞中的测试功效显示，A3G-BE 2.1和A3G-BE 4.4均可有效地域分持续C区域中的靶向C和无关C，而BE4 max则无选择性地将两个持续的C全部编辑。

为了进一步提高A3G-BE的编辑效率，他们通过阐明A3G的C端布局域中的要害氨基酸，设计了三组突变，别离用于增强脱氨催化活性，增加ssDNA团结亲和性，提高卵白质溶解度。

而为了保存A3G的高选择性，研究者同时又引入Y315F来晋升非特异性DNA团结，从而最终优化获得了A3G-BE 5.13和A3G-BE 5.14。个中，A3G-BE5.13的碱基编辑活性稍高，A3G-BE5.14的选择性稍高。“两种新CBE可以在差异景象的多C编辑中互补。”左二伟说。

Y315（绿色）与ssDNA彼此浸染的放大视图。DNA主链5′磷酸基与Tyr315羟基之间的氢键，以及它们之间的彼此浸染 靶胞苷（dC0）和Y315的环用虚线暗示。左二伟供图

精确性安详性俱佳

为了验证改革后的A3G-BE，他们将A3G-BE 4.4、A3G-BE 5.13和A3G-BE 5.14用于在细胞系中构建疾病模子和校正单碱基突变疾病，并与BE4max对较量。

左二伟先容，功效显示，改革后三种A3G-CBE可以或许选择性地对5′-CC-3′序列中第二个C而非第一个C举办编辑，明明区分了靶向C和无关C，并生成了高占比的方针基因型，而BE4max则无法发生抱负的靶向C编辑功效。

值得留意的是，A3G-BE5.14在生成转甲状腺素模子淀粉样变的疾病模子的效率比BE4max 高613倍，更突出了其准确性的优势。